实验专栏

如何提取总蛋白?

大家目前最常用的方法是利用溶液法进行蛋白提取(如 RIPA 裂解液),但是往往会在蛋白质提取中产生两个不同的组分,即 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性组分。通常 RIPA 不可溶性组分被我们直接丢弃忽略。但是已经有文章证实许多蛋白质存在于被丢弃的 RIPA 不可溶性组分中。也就是说利用溶液法提取的并非是完整的总蛋白,而仅仅是一些可溶性蛋白。溶液法进行提取蛋白时会人工激活 caspase-3 和 caspase-7;还会人工激活某些激酶活性;影响磷酸化研究;影响细胞外基质;影响定量,定性蛋白研究。目前利用离心管柱式法进行蛋白提取,即可解决以上这些问题,只需加入裂解液,过柱离心,不产生不可溶组份,即可提取到完整的总蛋白!

动物组织总蛋白提取

变性总蛋白提取(SD-001)

以下步骤是从 15-20 mg 组织中提取,对于昆虫组织,例如果蝇,使用 15-20 个幼虫,蛹或成虫样本。如果起始量较大或者较小,需调整相应裂解液的用量比例。

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

2. 将 15-20 mg 组织放置于离心管柱上,用塑料棍扭转研磨 50-60 次,加入 200ul 细胞裂解液,继续研磨 30-60 次。(组织用量不要过量,无需过度研磨,裂解液可分两次加入以得到最佳效果)注意:塑料研磨棒可以重复使用,用蒸馏水彻底冲洗干净,用纸巾擦干。

3. 盖上盖子室温孵育 1-2 分钟,14000-16000rpm 离心 1-2 分钟取出。

4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。
请注意:部分未完全裂解的组织不会影响样品质量。

天然总蛋白提取(SN-002)

1. 将天然细胞裂解液(SN-002),离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2. 将 15-20 mg 组织放置于离心管柱上,用塑料棍扭转研磨 50-60 次,加入 200ul 天然细胞裂解液(SN-002),继续研磨 30-60 次。(组织用量不要过量,无需过度研磨,裂解液可分两次加入以得到最佳效果)。注意:塑料研磨棒可以重复使用,用蒸馏水彻底冲洗干净,用纸巾擦干。

3. 开盖冰上孵育 5 分钟,盖上盖子,4℃,14000-16000rpm 离心 1-2 分钟取出。

4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

细胞样品总蛋白提取

变性总蛋白提取(SD-001)

A.非贴壁细胞

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2. 低速离心收集细胞,在 1.5 ml 离心管中加入预冷的 PBS,旋窝震荡,3000rpm 离心 2-3 分钟清洗细胞。吸去上清,剩余与细胞体积相同体积的 PBS。涡旋震荡重悬细胞。

3. 加入表格 1 中相应体积的细胞裂解液,涡旋震荡裂解细胞。(细胞数量和裂解液须保证对应关系,以达到最佳提取效率)请注意:部分未完全裂解的细胞不会影响样品质量。

4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000rpm 离心 30 秒取出

5. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格 1,不同细胞体积应加入相应体积裂解液

细胞体积(ul) 裂解液(ul) 相当细胞量# X 106
3 20 0.3
5 50 0.5
10 100 1
20 200 2
40 500 3

﹡ NIH3T3 和 293T 细胞 10ul 体积相当于 1X106 个细胞

B. 贴壁细胞

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板,培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞,吸去上清。

3. 按照表 2 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面,用移液器吹打几次,将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000rpm 离心 30 秒取出。(如提取浓度不佳,可减少裂解液使用量)

4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格 2,不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液

器皿 细胞数量 裂解液(ul)
24孔板 0.1-0.2 Million 50
6孔板 0.6-0.8 Million 200
25 cm2培养瓶 1.5-2 Million 500

天然总蛋白提取(SN-002)

A.非贴壁细胞

1. 将天然细胞裂解液(SN-002),离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2. 低速离心收集细胞,在 1.5 ml 离心管中加入预冷的 PBS, 旋窝震荡,3000rpm 离心 2-3 分钟清洗细胞。吸去上清,剩余与细胞体积相同体积的 PBS。旋窝震荡重悬细胞。

3. 加入表格 3 中相应体积的细胞裂解液,涡旋震荡裂解细胞 15 秒。将离心管放置于冰上 3-5 分钟然后涡旋震荡 10 秒。(细胞数量和裂解液须保证对应关系,以达到最佳提取效率)

4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000rpm 离心 30 秒取出

5. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格 3,不同细胞体积应加入相应体积裂解液

细胞体积(ul) 裂解液(ul) 相当细胞量# X 106
3 20 0.3
5 50 0.5
10 100 1
20 200 2
40 500 3

﹡ NIH3T3 和 293T 细胞 10ul 体积相当于 1X106 个细胞

B 贴壁细胞

1. 将天然细胞裂解液(SN-002),离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板,培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞两次,吸去上清。

3. 按照表 4 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面,放置于冰上孵育 5 分钟,用移液器吹打几次,将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000rpm 离心 30 秒取出。(如提取浓度不佳,可减少裂解液使用量)

4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格 4,不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液

器皿 细胞数量 裂解液(ul)
24孔板 0.1-0.2 Million 50
6孔板 0.6-0.8 Million 250
25 cm2培养瓶 1.5-2 Million 500

文章来源于丁香通

相关新闻

联系我们

0512-83377216

137-7184-1836

在线咨询:点击这里给我发消息

邮件:2090855807@qq.com

工作时间:周一至周五,9:30-18:30,节假日休息