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胎牛血清使用方法、保存方法以及常见问题汇总

胎牛血清使用方法、保存方法以及常见问题汇总

一、Gibco胎牛血清使用方法

         在细胞培养过程中,经常加入5%-20%的Gibco胎牛血清,最常使用的Gibco胎牛血清浓度是10%。高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱,影响后续实验的结果,我们在实验中使用10%的Gibco澳洲胎牛血清培养293T细胞,效果非常好。但是有些细胞也会使用5%的Gibco胎牛血清或者20%的Gibco胎牛血清,要根据具体细胞选择合适的Gibco胎牛血清浓度。

二、 Gibco胎牛血清保存方法

1、需要长期保存的Gibco牛血清,例如Gibco南美胎牛血清,必须储存于-20℃ – 70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。切勿将血清在37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会被破坏,而影响血清质量。如果一次无法用完一瓶,可将40~45ml分装于无菌50ml离心管中。由于血清结冰时体积会增加约10%,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。

2、一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。如发现Gibco牛血清有悬浮物,例如Gibco北美胎牛血清中发现有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清。

3、瓶装Gibco胎牛血清南美解冻需采用逐步解冻法:-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室温,待全部溶解后再分装,一般以50ml无菌离心管可分装40~45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沈淀的发生。.切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。

4、热灭活是指56℃, 30分钟加热已完全解冻的血清.加热过程中须规则摇晃均匀.此热处理的目的是使血清中的补体成分灭活.除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量.补体参与反应有:细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。

5、血清中的沉淀物和絮状物:主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量.可用离心3000rpm,5分钟去除,也可不用处理。 显微镜下”小黑点”:经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象”小黑点”,常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。

三、 Gibco胎牛血清使用中遇到的常见问题总结

血清灭活问题。

1、问:加到培养基中的血清必须灭活吗?

答:不是必须的,看做什么实验,我在使用Gibco南美血清10270106的时候,都不灭活。

2、问:Gibco胎牛血清新西兰(Gibco新西兰血清10091148)灭活是56℃ 30分钟吗?

答:如果用于培养大多数的肿瘤细胞,血清一般是不需要灭活的,例如经常使用Gibco新西兰胎牛血清,是不用热灭活的,这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞,如内皮细胞,血清是需要灭活,一般是56℃,30min。

3、问:我要做滋养细胞培养,Gibco北美胎牛血清要灭活吗?

答:一般的细胞培养中使用到的Gibco胎牛血清,例如Gibco ES专用胎牛血清是不用灭活的。如果一定需要灭活,可以直接购买Gibco胎牛血清澳洲热版本,进口Gibco澳洲胎牛血清热灭活的一般都已灭活。灭活的Gibco血清价格一般比未灭活的Gibco血清价格要高很多。

4、问:我用病毒上清转染细胞,培养用的血清需要灭活吗?因为血清中可能有些补体和抗体,是不是会影响转染?我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合,影响转染,正确吗?细胞是单核细胞白血病细胞,病毒是病毒包装细胞PT67收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时,目的是什么?

答:血清一定要灭活,可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰,一般是2-6小时,根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活,灭活的目的是将血清中的补体灭活!这要根据实际情况而定,如果没有把握那就灭活吧,也不麻烦56度半个小时。

5、问:(1)我买的是Gibco胎牛血清北美,要灭活吗?有些说法是需要,有些说直接解冻后就可以加入到培养基中;我配制胰蛋白酶液,用的是D-PBS,有关系吗?

答:关于血清的热灭活,是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行,因为有两个作用,一是灭活补体,第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响。

我在实验室处理Gibco胎牛血清新西兰的时候,有一次水浴箱在灭活过程中出现故障,温度升高到80℃,血清变成了凝胶状,我重新处理了另外一份Gibco胎牛血清南美,将两份血清对比,发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以上,肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试,看看到底有多大的影响。热灭活之后,血清放在四度冰箱久了,就会有沉淀产生,这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染,常常又会把血清放置37℃温育,但是血清中的蛋白会进一步析出,最后还是要做镜检,无菌培养试验,和革兰氏染色试验,非常麻烦。

我看过一份资料,里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间,而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高,许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立,只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株,发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE,MDBK,Vero,成纤维细胞,MRC-5)的生长带来负面影响,三个细胞株(FOX-NY,MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响,而只有两个细胞株(Balb/3T3,Sp2/0Ag14 hybrid),在热灭活之后,细胞生长有轻微的改善。所以,在正常的操作下,热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。

你可以摸索一下,Gibco北美血清16000044从-20℃冰箱拿出来之后在常温解冻,然后混匀分装成两份,一份灭活,一份不灭活,比较这两种Gibco北美血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。

问:(2)分装后的Gibco澳洲血清10099141血清从-20℃取出放4℃让其液化,却见Gibco澳洲血清10099141血清比较混浊,有沉淀产生,这属正常吗?

答:正常。

Gibco胎牛血清的保存问题。

1、问:2016年6月到期的GIBCO胚胎干细胞专用(Gibco ES专用血清16141079)胎牛血清到2017年5月还能用吗?

答:只有试试了,如果一直在-20℃冻着来者,应该还可以,先少用点看看。养细胞系应该没问题,原代不行。

2、问:请问我自然溶化好的Gibco澳洲血清10099141和1640培养基今天用不上,明天用,我不想放到冰箱里,放在室温下一晚行吗?100毫升培养瓶加多少培养基呢?

答:可以放4℃。4-5ml。

3、问:4℃冰箱内保存3个月的Gibco南美血清,能否继续使用?相关细胞和其它试剂的代价比较高,不敢轻易尝试。

答:需要长期保存的Gibco胎牛血清必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中,4℃冰箱中保存时间不要超过1个月。

Gibco牛血清灭活时温度问题。

1、问:因为实验室水浴锅失控,血清灭活时,温度到了61.7℃,这血清还能用吗?

答:多长时间啊?短时间应该可以吧,我有一次加热了一个多小时,还照样用。

2、问:我灭活Gibco胎牛血清时,用的电磁炉,定在了70℃,本来说调温度到56℃再放血清的,后来忘了,就把血清放进去了,所以灭活的温度肯定超过56℃了,不知道这样对血清有没有影响?

答:常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间,而时间则从15分钟到60分钟不等,其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。看看你养的细胞是什么,一般的话估计问题不大,要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质, 在对补体灭活以外,热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。现在好像不主张热灭活,热灭活经常给血清产品带来负面影响,对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生,此外,有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

FBS可否代替人AB型血清?

问:我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养,文献上要求用人的AB型血清,但是我觉得很多代理商都没有。我想FBS代替,但不知道可否,我先是担心免疫排斥之类,但是我查了些资料后,应该不会(我觉得)。但是我又不能够TRY。因为细胞因子确实太贵了,所以咨询一下。谢谢!

答:你照文献的做。除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂)。细胞培养的影响因素很多,特别是培养基的成分。

血清的制备方法问题。

1、问:我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞,有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备过程?

答:自己制备血清当心污染啊,我们一般不自己制备胎牛血清,我们是购买的Gibco牛血清,Gibco新西兰血清10091148,效果非常好,也很稳定。如果无菌条件好的话,用静置析出方法就行。

2、问:一般我们用得Gibco胎牛血清用前还要灭活,我想用大鼠的血,不知道要不要灭活?

答:你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜,离心,取上清,在无菌过滤,也可灭活,然后分装冻存,用时再配。

3、问:如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤?

答:加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。灭活一般不会对血清中的一些因子损伤的。

六、心肌细胞原代培养时Gibco牛血清的使用问题。

1、问:在进行心肌细胞原代培养时,需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用,我现在使用的是含血清10%的培养液,但近日看北医一个细胞培养的课件发现,有用1%血清培养液进行中止消化的,想问一下,1%的是否可以,效果是否有保证?这样确实能节省不少血清的。

答:关于心肌细胞元代培养的FBS问题:

(1)1%的血清完全培养基可不可以,得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。 10%的FBS完全培养基效果都不太好,开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS,20%左右,但这就有出现另一个问题,在FBS完全培养基中,成纤维细胞呈优势细胞,须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长,纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶,只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用,有讲究:刚开始使用20%左右的高浓度的FBS,后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问:我胰酶的用量是0.08% ,并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊,难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗,还有,我的BRDU只用到48小时就不用了,因为担心其损伤太大,可以持续用多久呢?

答:我用10%FBS终止的,然后差速1h,然后还是用10%FBS的HG-dmem养的,没有用brdu,心肌细胞还是比较多和稳定的,我第3天就可以用,第2天晚上看就会有搏动。

七、血清和培养基的种类及品牌问题。

1、问:细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢?周围有人用PAA或Hyclone的,这两种跟Gibco或sigma出品的差别大吗?

答:如果是长得非常快得细胞如pa317,293,c6等恶性肿瘤细胞,一般得国产血清就可以,如果是原代培养的细胞,应用胎牛血清或类标准胎牛血清,Hyclone公司血清的质量不如GIBCO(同类血清)。国产的杭州四季青和甘肃民海(中美和资)不错。有些细胞(如:sf9,293还有其他一些元代细胞),用Gibco的比其他两种好很多,会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如:vero,MDCK,pk)四季青,Hyclone的小牛血清足矣!另外,Gibco的还要看产地,不同产地的Gibco血清价格不一样。在这些所有血清品牌中,Gibco血清价格较高,质量也比较稳定。

2、问:最近要订一瓶Gibco北美血清16000044,实验室之前都在用小牛血清,没有买过Gibco胎牛血清。请问哪个公司的好一些?问过试剂公司,有两种:一种是PAA的(分普通级和优级),一种是Hyclone的(只有普通级,而且是新西兰产的)。试剂公司推荐使用PAA优级的,但看好多文献都用Hyclone的,公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请问用的哪种胎牛血清比较好?

答:民海的效果还不错,要是不放心国产的,那就买进口的。进口的好多公司都有,Gibco新西兰血清的效果很好。Hyclone和Gibco的都还可以。民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错。

3、问:四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别?培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些?

答:用无支原体Gibco澳洲胎牛血清就可以啦。

4、问:SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清?

答:我一直用GIBCO的1640,你可以买含HEPES的1*10L的包装,胎牛血清也是用的GIBCO,10%就行。

八、Gibco牛血清污染噬菌体的问题。

1、问:有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染,以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够除去噬菌体?

2、问:我也想知道,我用的血清中大部分都有噬菌体,它对细胞培养到底有什么影响?

答:不知道您究竟使用的什么血清,我们使用的Gibco胚胎干细胞专用血清16141079,没有任何噬菌体。建议您立刻更换胎牛血清,推荐您使用Gibco胎牛血清,具体的产品货号是:Gibco南美胎牛血清(Gibco南美血清10270106)、Gibco北美胎牛血清(Gibco北美血清16000044)、Gibco澳洲胎牛血清(Gibco澳洲血清10099141)、Gibco新西兰胎牛血清(Gibco新西兰血清10091148)、Gibco ES专用胎牛血清(Gibco ES专用血清16141079)。

九、培养基血清浓度问题。

问:在1640里加血清时加多了,90ml里加了20ml Gibco新西兰血清10091148,约为18%,以前都是加10ml的,查了网上多建议用10%-15%,有关系吗?

答:我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大,建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大当然细胞状态感觉要好,但是高浓度的Gibco澳洲血清10099141可能改变细胞的基因表达谱,影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟癌细胞很好。

十、问:MTT加药的时候加不加血清?加药时要用无血清的培养基吗?

答:我的药就是用含Gibco澳洲胎牛血清的培养基稀释的,不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用,无形中对细胞造了一个serum-free的模型,细胞在提内本来就是有血清供应,如果该药物都不能对抗,那该药物就没有什么临床价值了,这是我的理解。

十一、PC12细胞培养所用血清问题。

问:我正准备购买上海细胞所的未分化的PC12细胞,需要灭活的马血清,可现在买血清很困难,好像是海关有封锁,代理商这么说的,我原定购买的Gibco的horse surum,现在无法买到了,好容易找到一个目前可以进血清的公司Hyclone,有一种Donor Equine serum是马血清吗?

答:Hyclone的Donor Equine serum可以用,我以前用的就是这个。我当时是在鼎国(重庆办事处)买的,100ml大概140元,具体不记得了。当时是看它比别的进口的马血清便宜。另外:我买了以后灭活的。

十二、AB血清的制备问题。

问:本人想从人的外周血中分离AB血清的,用于B淋巴细胞的培养。谢谢大家给点建议。人的血,来之不易啊。

答:是AB血型人的血清吗?这种血清即没有抗A型抗原抗体,也没有抗B型抗原抗体。分离血清时将采集的血液注入试管中,待血液凝固后离心分离血清。可将采集的血液放在37℃水浴箱中促进血液凝固,减少凝固时间。离心可在2500~3000rpm,10min,足可以分离血清。分离后将血清吸出保存即可。分离血清的量可按采集血液的50%左右计算,因为红细胞占总血液的50%左右。当然整个过程要注意无菌操作。

十三、Gibico的胎牛血清内是否含糖?

问:我想做糖诱导细胞凋亡的试验。细胞培养液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖对我实验的培养液糖终浓度影响比较大。今天打电话问GIBCO公司的技术顾问,回答我糖浓度少于5μg/ml,因此基本可认为是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我们医院检液科,结果却是:6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。难道是检测人血清的血糖浓度的方法不能用于检查牛血清吗?(另起茶水验尿事件?)检验科没有给我回答。

答:应该是不含糖的。请参照gibco的网站:第五页我做了个记号。直接点击链接就可以看到它的说明书页面。我想我们肯定要以公司的说明书为准。至于为什么检验科测起来有误差,我想可能是样本不一样,需要用标志品矫正有关。具体需要检验科的战友解释了。

十四、血清或培养基产生了颜色或沉淀的问题:

1、问:我用的是Gibco胎牛血清澳洲,56℃30分钟灭活后出现了白色少量絮状沉淀,是不是污染?还能不能再用?血清的生产日期是2006年7月(现在是2007年6月11日)。

答:应该问题不大。你可以取少量血清放入培养皿中,37℃过夜培养看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

2、问:我用MTT法测细胞的增殖,用DMSO裂解细胞,发现把DMSO加入到孔中就会形成乳白色(用的含胎牛血清的1640培养基,由于没有离板子的离心机,所以没有去除培养基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培养基没有看到有这种情况。该怎么解决?

答:为什么要用离心机离心呢?难倒你养的是悬浮细胞吗?如果是贴壁细胞的话直接将MTT倒掉,再加DMSO即可,我们就是这么做的,效果很好!并且测细胞的增殖的话如果不去掉MTT就加DMSO的话误差应该很大!有时不一定就是血清的原因,可能跟你的MTT放置的时间或以及其他成分有关!

3、问:(1)GIBCO胎牛血清500ml,今天解冻后没有混匀直接分装,结果使得前面的几管是清亮的,后面就带有棕色的,不知有没有影响?估计有什么影响?前面的成分好还是棕色的成分好啊?

答:肯定有。还是重新混合重新分装,我觉得有效成分会集中在棕颜色部分。

问:(2)为什么会出现棕色呢?

答:血清中的棕色多一些可能是因为红蛋白的含量高些的缘故吧。

问:(3)血清灭活之后可以存放吗?我的是前天灭活的,但是没有加到培养基里,而是放在冰箱里,那下次可以直接用吗?还是再次灭活啊?

答:当然可以,如果多的话,分装后放在-20℃,下次用时再解冻,也不用再灭活。用一管拿一管,少许血清可以放在4℃。分装时还要注意不要装得太满,以免溢出污染。

十五、污染和过滤的问题。

1、问:怀疑购买的Gibco胚胎干细胞专用胎牛血清(Gibco ES专用胎牛血清)染菌,想用滤膜过滤一下,可否自己用0.22μm滤膜过滤?对血清性质有多大影响?有做过的么?

答:可以过滤的,血清当出厂时都是0.22μm或0.1μm过滤除菌。想证明有没有染菌不用过滤这么麻烦,只要放置于37℃过夜就可以了,如果有微生物污染会变浑浊的,如果还是澄清的就说明没有问题的。实验室中血清很难直接过滤,一般要加到培养基中再过滤。我们实验室制备培养基时,都使用滤膜过滤,一般而言如果制备1-2瓶培养基,一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛血清。如果大量制备培养基也可以将血清加到培养基中,使用0.22微米的大滤膜一起过滤。

2、问:我怀疑我用的完全1640培养液被污染了,准备重新过滤消毒,过滤后是否需要补充胎牛血清?如需又如何补充?

答:完全1640培养液被污染了,如果是支原体的话,过滤没有作用,支原体可以通过滤膜。我们用1640液,都是配液后保留500ml,然后其他的分装100-200ml,现用现配因为血清比1640要贵,如果你想过滤的话,建议你加原比例血清,因为Gibco牛血清不会很容易通过滤膜。最主要的还是找到可能污染的原因。

3、问:加好了Gibco牛血清双抗的培养基由于污染了再过滤后还能用吗?

答:建议不要用了。在加了双抗的情况下已经污染,那么细菌污染的可能性会较小了。一般的过滤除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、问:我准备把使用的完全1640培养液重新过滤一遍,不知道培养液中的血清成分是否能通过滤膜,过滤后是否还需要补充胎牛血清?如需又如何补充?

答:可以透过,但是随着液体量的增多会很慢,如果不加压会比较麻烦,还有用低蛋白吸附的,不然损失是比较大的。

十六、问:悬浮细胞培养时能否加Gibco胎牛血清?如果加了会有什么结果?为什么悬浮细胞培养时就不能加Gibco血清?

答:血清是细胞培养基中重要的培养成份之一,对细胞生长有广泛影响。在细胞培养时,我们通常会加入10%的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要。一般说来,牛血清包括以下成分:生长因子(如激素,白细胞介素等),他们可以促进细胞生长;贴附因子,他们可以促进细胞的贴壁,往往只有细胞贴壁才能增值(悬浮培养的细胞除外);蛋白质(如血清白蛋白,球蛋白等),既可以作为营养物质,又可以中止胰酶的作用;还有很多成分不明的物质。血清还可以起到解毒作用,如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤。因此,无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,血清是必不可少的。除非因实验要求无血清培养时,例如:为使细胞同步化时,我们会采用无血清培养的。单纯的说悬浮细胞培养不能加Gibco胎牛血清就没有太多的道理了。

十七、关于中和消化液需要的血清量。

问:用胰蛋白酶消化细胞后,需要用血清中和。具体这种中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之间的比例是多少?

答:做了很久的试验,真的没有想过胰酶和血清的对应关系。不过细想下来,这个应该也没有固定的比值。血清的品种、产地都是不同的,成分必然有差异,如何能确定其与胰酶的比值关系?我们消化细胞的时候,如果是传代,细胞变形后,吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培,这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中止消化的。不会存在继续消化的事情。如果是从组织上消化细胞做原代培养,我一般都使用全培进行中止,而且加的很多,0.25%的胰酶,用10%血清,按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2,一般我养细胞的时候,会用国产的比较便宜的血清配制全培,专门用于中止消化,这样有几个好处:一是中止消化的效果应该好于hanks液吧,再是也有利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉,血清便宜,离心掉了不会心疼。而养细胞的时候用好血清。个人观点,仅供参考。

十八、Gibco胎牛血清新西兰中的悬浮物问题。

1、问:发现培养的细胞瓶中背景有许多的小黑点,培养液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以为是胶原虫。本打算换液,换液前特意看了下前些天配的培养液,肉眼发现培养液中有悬浮的颗粒状物质(不多),于是放在镜下观察,新鲜培养液中有一些悬浮的小颗粒,不多。(培养液是R1640+20%Gibco小牛血清+1%双抗)于是又将分装在4℃保存的小牛血清拿出观察,肉眼可见5、6个白色小小球状的物质,在血清瓶稍靠下的部位悬浮。镜下观察,也有少量的不知什么物质的东西漂浮。小牛血清是Hyclone新西兰的,标签上写已经经过2μm滤膜过滤处理。根据上述培养液的情况,是否说明培养液已被污染?如果是正常的血清是不是在镜下不应该看到杂物,哪怕是极少量的?根据上述血清的描述,是不是说明血清也存在问题,还能用吗?补充:细胞培养以来生长状态就不好。买血清的时候厂家说明不用灭活,所以未灭活。

答:(1)Gibco血清应该-20℃保存,解冻血清时,请按照的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大实验显示非常容易产生沉淀物。

(2)Gibco澳洲血清10099141中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白在Gibco胎牛血清解冻后,也会存在于血清(例如Gibco新西兰胎牛血清10091148)中,亦可造成沉淀物。

(3)若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装血清,再放回冷冻,若存放于4℃时,请勿超过一个月,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白,可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

(4)解冻Gibco胎牛血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

(5)排出了Gibco血清(例如Gibco新西兰胎牛血清10091148)的原因,在考虑实验用品和无菌操作的问题。

(6)细菌病毒、衣原体、黑胶虫污染也很常见,如果细胞死的太多,影响较大建议更换培养液。

2、问:今天在配培养液时,发现Gibco血清里面有小碎片样的漂浮物,血清仍然清亮,不浑浊。不知道是什么,问了实验室的学长,说仍然可以用,但还是不放心,没有用血清。求助园子的各位达人,这可能是血清出了什么问题?我的血清用了一个月不到,四季青的。

答:可能的原因:(1)培养液配置时Votex不够,当时是清亮的,但过一段时间会析出来;(2)真菌污染。

十九、更换无血清培养基后细胞大量死亡的问题。

问:我使用Lipofectamine2000转染成骨细胞,在转染前要换上无血清的培养基。本来条件模的好好的,转染效率也可以接受。但是寒假一回来就发生了怪事:细胞在有血清的培养基中长的好好的,一换无血清的培养基就死亡。大概4个小时就能看到较多的细胞飘起来。但是原来我换无血清培养基,就算放那里10个小时都是没问题的啊。已经换了不同批次的培养基,甚至吸管什么的都换过了,但是就是不行,是怎么回事?

答:(1)两周后的培养液应补加谷氨酰胺,或者重新配液,转染时应不含抗生素。

(2)确认操作方法和环境,建议检查一下。

(3)Lipofectamine2000,脂质体的毒性很大,如果有质粒参与对细胞损伤更大,如果Lipofectamine2000在常温放置过,对细胞更大,假期冰箱是否断过电。

(4)培养箱的温度、c02浓度,湿度。

二十、完全培养液的相关定义。

问:“完全培养液一词”,是指加了血清的培养液吗?我在做含药血清的实验,涉及到血清添加量的问题。所以想弄明白文中所指的“完全培养液”是否是含药血清。

答:原液是指配置后过滤除菌。不完全培养液是指不含有血清,例如Gibco北美胎牛血清的原液,其他成分已补充。完全培养液是指不完全培养液加入血清(例如Gibco胎牛血清北美)后称完全培养液。

二十一、血清相关知识总结。

使用Gibco胎牛血清的注意事项:

血清是细胞培养中最重要的元素之一。下面是实验室里使用Gibco胎牛血清,例如Gibco北美胎牛血清,常会遇到的问题,仅供大家参考:

1、保存Gibco牛血清的方法:

建议Gibco血清应保存在-5℃ 至 -2O ℃ 。然而,若存放于 4 ℃ 时,请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。

2、如何解冻Gibco胎牛血清才不会使产品质量受损:

建议您将Gibco南美胎牛血清10270106从冷冻箱取出后,先置于2~8℃ 冰箱使之溶解,然后在室温下使之全溶。但必须注意的是,溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理:

血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物,可以将Gibco血清分装至无菌离心管内,以400g稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、何谓热灭活:

一般是以 56℃ , 30 分钟来处理已解冻的Gibco南美血清10270106,因为此加热步骤,可以使补体去活化,而补体所参与的反应有 : 溶细胞活性,平滑肌的收缩,肥大细胞和血小板组胺的释放,增强吞噬作用,淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、关于Gibco胎牛血清的灭活:

有必要做热灭活吗?

实验显示,经过正确处理的热灭活Gibco血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的Gibco澳洲胎牛血清10099141(Gibco澳洲血清)对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒立显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在 37℃ 环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您,若非必须,您可以不需要做热处理这一步。如此一来,不但节省您宝贵的时间,更确保您血清的质量!

6、血清相关知识:

如何避免Gibco胎牛血清沉淀物的产生?

我们建议您在使用Gibco牛血清,例如Gibco南美胎牛血清的时候,注意下列的操作 :

(1)解冻Gibco胎牛血清南美时,请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),实验显示非常容易产生沉淀物。

(2)解冻Gibco胎牛血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。

(3)请勿将Gibco北美血清16000044置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。

(4)Gibco南美血清10270106的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。

(5)若必须做Gibco胎牛血清的热灭活,可以直接购买Gibco胎牛血清的热灭活产品,但是灭活的Gibco血清价格较高。自己制备Gibco胎牛血清澳洲热灭活的时候,请遵守56℃,30 分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。

Gibco胎牛血清选择指南

Standard(标准)Gibco最普通级胎牛血清,适合于较容易培养的细胞。
 来源目录号规格备注
胎牛血清,QualifiedUSDA-approved regions10437028500 mL 
10438026500 mL热灭活
南美洲10270106500 mL 
10500064500 mL热灭活
加拿大12483020500 mL 
12484028500 mL热灭活
Performance(优)Gibco低内毒素血清,用于普通细胞系的常规培养,比标准级胎牛血清质量要好。
 来源目录号规格备注
胎牛血清,Qualified美国,北美26140079500 mL 
16140071500 mL热灭活
Performance Plus(优+)Gibco 最低内毒素血清,通过内激素和多种生化检测,适用于广泛的细胞系培养,尤其适合敏感细胞系的日常培养。
 来源目录号规格备注
胎牛血清,Certified美国,北美16000044500 mL 
10082147500 mL热灭活
Secure(极好)Gibco血清,来源于无疯牛病疫情(BSE-Free)区域,低内毒素,适用于要求病毒感染风险最低的细胞培养。
 来源目录号规格备注
胎牛血清,Qualified澳大利亚,澳洲10099141500 mL 
10100147500 mL热灭活
新西兰10091148500 mL 
10093177500 mL热灭活
新生牛血清(Newborn Calf Serum,小牛血清)新西兰16010159500 mL 
26010074500 mL热灭活
成年牛血清(Bovine Serum)16170078500 mL 
26170043500 mL热灭活
供体牛血清(Donor Bovine Serum w/Iron)10371029500 mL 
供体牛血清(Donor Bovine Serum)16030074500 mL 
Specialty(专用)Gibco血清,适用于有特殊要求和特殊实验研究的细胞培养。
 来源目录号规格备注
胚胎干细胞专用胎牛血清(ES专用胎牛血清,Embryonic Stem Cell Qualified)美国,北美10439024500 mL 
新西兰16141079500 mL 
间充质干细胞专用胎牛血清(Mesenchymal Stem Cell Qualified)USDA-approved regions12662029500 mL 
新西兰12665022500 mL 
澳大利亚,澳洲12664025500 mL 
活性炭处理胎牛血清(碳吸附处理胎牛血清)USDA-approved regions12676029500 mL 
透析型胎牛血清美国,北美26400044500 mL 
新西兰30067334500 mL 
外泌体清除胎牛血清(Exosome-Depleted)美国,北美A2720801500 mL 
超低IGg胎牛血清美国,北美16250078500 mL 
新西兰1921005PJ500 mL 
马血清新西兰16050122500 mL 
26050088500 mL热灭活
羔羊血清(Lamb Serum)16070096500 mL 
鸡血清16110082500 mL 
山羊血清(Goat Serum)16210072500 mL 
猪血清26250084500 mL 
兔血清美国,北美16120107500 mL 
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