细胞凋亡检测试剂盒

细胞凋亡

细胞凋亡大致可以分为三个阶段，包括凋亡早期、凋亡中期和凋亡晚期。每个阶段都具有各自的细胞形态学变化和分子特点。

凋亡早期：细胞膜通透性改变；磷脂酰丝氨酸外翻；起始 Caspase 激活；线粒体膜电位改变

凋亡中期：效应 Caspase 被激活，细胞内特定蛋白被 Caspase 切割

凋亡晚期：DNA 断裂；凋亡小体形成；凋亡小体被吞噬细胞吞噬

图1：细胞凋亡过程

图2：细胞凋亡的不同阶段

细胞凋亡检测

凋亡早中期检测

线粒体膜电位检测法

JC-1是亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。正常生理状态下，线粒体负电性高，JC-1进入线粒体以多聚体存在，红色荧光强，细胞凋亡时，线粒体去极化产生，负电性降低，JC-1则以单体存在细胞质，绿色荧光增强。 

图3：JC-1线粒体膜电位检测的流式对比图

凋亡中晚期检测

Caspase-3活化检测法

正常细胞中Caspase-3以酶原形式存在于包浆中，在凋亡的早期被激活，活化的Caspase-3，有两个大小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。通过特异性抗体检测全长或检测后的的Caspas活性。

方法：

①收集细胞

②预冷PBS洗涤

③固定破膜

④染色洗涤重悬上机

实验方法：WB,IF,IHC,ELISA,FLOW

选用适当的底物，就可以实时监测活细胞中Caspase-3活性。底物为耦合DNA绿色荧光染料的多肽DEVD,该底物中的DEVD是Caspase-3/7的识别序列，并带有大量负电荷。在凋亡细胞中被Caspase-3/7识别并剪切，释放出活化的DNA绿色荧光染料分子。活化的DNA绿色荧光染料分子迁移进入细胞核，与DNA结合后，形成GreenNuc-DNA复合物就可以被激发而产生明亮的绿色荧光。

图4：GreenNuc活细胞Caspase-3活性检测试剂盒的检测原理图

凋亡晚期检测

DNA片段化检测-TUNEL检测法

TUNEL 染色检测细胞凋亡的原理

TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick-End Labeling，脱氧核苷酸末端转移酶 TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记）
TUNEL 法要素：TdT 酶、dUTP、DNA 缺口标记。
TdT 酶：末端脱氧核苷酸转移酶，是一种不需要模板的 DNA 聚合酶，可以往 DNA 上加碱基，可以催化脱氧核苷酸结合到分子的 3’-OH 端，带有凸出、凹陷、或平滑末端的单双链 DNA 分子都可以作为 TdT 的底物。
dUTP：2’-脱氧-5’-三磷酸尿苷，在 PCR 和 rtPCR 反应中可以替代 dTTP，从而防止扩增的干扰，导致产物中含有尿嘧啶。
△ 使用 dUTP 的 TUNEL 法是基础版，plus 版用 BrdU、EdU 替代 dUTP，因为 BrdU、EdU 插入 DNA 的效率比 dUTP 高，且 BrdU、EdU 有抗体，可以再用抗体检测 BrdU、EdU。
DNA 缺口标记：即检测到的阳性信号应该是位于 DNA 缺口处的。
正常细胞基因组断裂很少，细胞凋亡时，DNA 内切酶激活，切断核小体间的基因组 DNA，断裂造成的缺口处会出现很多暴露的 3’-OH。
TdT 酶可将标记的 dUTP 加到暴露的 3’-OH，根据标记可以进行后续观察。FITC 绿色荧光标记的 dUTP 通过荧光显微镜或流式细胞仪检测，生物素标记的 dUTP 用 DAB 显色后通过显微镜检测

图5：TUNEL 染色检测细胞凋亡的原理图

TUNEL 法一旦检测到细胞凋亡，就说明细胞已经到凋亡晚期了，因为细胞凋亡晚期时 DNA 才被切成一段一段的，早期不容易检测到。

TUNEL 染色检测细胞凋亡的操作流程

• 适用于检测培养的细胞爬片、悬浮细胞的甩片或涂片、石蜡组织切片或冰冻切片样本。

• 样本不同，处理方式有所不同：

图6TUNEL染色检测细胞凋亡的操作流程图

1.样品准备：
细胞爬片：将灭菌玻片放入 24 孔板，单细胞悬液加入孔中培养过夜。
石蜡/冰冻切片：脱蜡水化。
2.PBS 洗： 细胞爬片准备好后 PBS 洗 1 次， 5min。 （如果细胞贴得不牢，可以干燥样品，使细胞贴得 更牢，或省略此步直接固定）
3.固定：贴壁细胞或细胞涂片用 4%PFA 室温固定 30min；冰冻切片用 4%PFA 室温固定 30-60min（不要 使用酸性固定液，容易导致出现假阳性；不要使用乙醇或甲醇固定，会导致后面 TUNEL 标记效率降低） ；石蜡切片可短暂固定 5min（脱蜡水化后如果怕片子掉，或后续操作步骤多，片子变得乱糟糟不好看， 可以再用 4%PFA 做后固定 5min） 。
◆ 无 论是什么样品，固定一定要迅速且充分，因为有的组织核酸酶活性比较高，容易出现假阳性。 固定时间不宜过长，会导致蛋白和 DNA 交联在一起，降低 TUNEL 标记效率。
4.PBS 洗：弃固定液， PBS 洗 3 次，每次 5min。（冰冻切片洗 2 次）
5.透化：细胞用 0.3% Triton X-100，室温孵育 5min 透化；冰冻切片用 0.5% Triton X-100，5min；石蜡切片使用 20μg/ml 不含 DNA 酶的蛋白酶 k 处理，20-37℃作用 20-30min，不同组织的最佳温度和时间需摸索。
6.PBS 洗：弃透化液， PBS 洗 3 次，每次 5min。（可以多洗几次，必须把蛋白酶 K 洗干净，因为后面是用酶标记的，不洗干净会严重干扰后续标记反应）
◆ 如果 dUTP 是用生物素标记的，后面用 DAB 显色，那所有类型样品都要加内源性过氧化物酶封闭，用 PBS 配制 0.5%H2O2室温封闭 20min，封闭后再用 TdT 配套的 Buffer 配制的 0.05%BSA 室温封闭 10min。
7.TUNEL 反应：用 TdT 配套的 Buffer 配制的 TUNEL 检测液（含 200U/ml TdT）和 2-4μM dUTP 滴加到细胞爬片或组织切片样品上，37℃避光孵育 60min（如果是生物素标记的 dUTP 不用避光），注意防 TUNEL 检测液蒸发（可以将实验室常备的封口膜剪成合适大小的长条或圆片，覆盖在样品上，同时可以使 TUNEL 检测液均匀覆盖到样品；也可以用阻水笔圈出一个区域进行染色，反应在湿盒中进行）。
8.PBS 洗：弃反应液，PBS 洗 3 次，每次 5min，抗荧光淬灭封片剂封片。
◆ 也可以用 DAPI 双染，有些细胞是不凋亡的，就只会被 DAPI 染色；凋亡的细胞会被 TUNEL 和 DAPI 染色。
◆ 悬浮细胞或细胞悬液透化之后，用 PBS 洗 2 次，加入 50ul TUNEL 检测液，37℃避光孵育 60min，PBS 洗 2 次，再用 PBS 重悬后用流式细胞仪检测，或涂片后用荧光显微镜观察。
荧光显微镜检测：观察和拍照。
9.FITC：激发光波长 450-500nm，发射波长 515-565nm。