RNA 干扰技术

简介

转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）被称为RNA干扰（RNAi），与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链 RNA（dsRNA）导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。

目前为止较为常用的制备 siRNA的方法有化学合成、体外转录、长片段dsR-NA经RNA酶I类降解（如Dicer，E.coli的RNA酶II）体外制备 siRNA，以及通过 siRNA 表达载体或者病毒载体、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

前面的3种方法主要都是体外制备siRNA，并且需要专门的RNA转染试剂将 siRNA转到细胞内。

而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于从转染到细胞的DNA模板中在体内转录得到siRNA。

这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

而将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转染至真核细胞中的方法不外乎以下几种：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物（polybrene）、机械法［如显微注射和基因枪（biolistic particle）］和阳离子脂质体介导的转染。

原理

siRNA 表达框架制备siRNA法的基本原理是： siRNA表达框架（siRNA expression cassettes，SEC）是一种由PCR得到的 siRNA表达模板，包括一个RNA聚合酶I启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA聚合酶II终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中，具体过程如图所示。

阳离子脂质体介导的转染的基本原理为：脂类的头部基团之间的离子相互作用，脂类的头部基团携带很强的正电荷，可中和DNA磷酸基团的负电荷，因而阳离子脂类可以与DNA自动形成可与细胞膜融合的单层外壳，从而将DNA导入细胞内。

来源：丁香实验