酶联免疫吸附实验

简介

1971年Engvall 和Perlmann发表了酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 用于IgG定量测定的文章，使得1966年建立的免疫组织化学酶标记抗体技术开始应用于液相微量物质检测中。

目前，用于酶联免疫吸附实验的方法主要有4种：间接法、双抗体夹心法、竞争法和生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）。

原理

酶联免疫吸附实验的基本原理是多数蛋白质、多肽、多糖和细菌脂多糖等抗原能够直接吸附到塑料材质（如聚苯乙烯）的固相载体表面，结合牢固足以耐受后续的洗涤过程而不被洗脱，同时仍然保持其生物学活性，例如吸附于固相载体表面的抗体（蛋白质），其结合抗原的功能不受影响。

酶与抗体（抗原）的共价结合不会影响复合物中抗体（抗原）和酶活性，应用最多、效果较好的有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原-特异性抗体-酶标二抗或抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物与其他物质分开，确保了在加入酶作用底物后产生的显色反应，其颜色深浅与结合在固相载体免疫复合物上的酶含量成正比，降低了非特异性显色，提高了检测敏感性。

HRP的底物为H2O2，催化反应式为：HRP+H₂O₂→HRP•H₂O₂+DH₂→HRP+D+2H₂0 其中，DH₂为供氧体，H₂O₂为受氢体。

DH₂-般为无色化合物，如邻苯二胺（O-phenylenediamine，OPD）和四甲基联苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine， TMB）。

经辣根过氧化物酶作用后成为有色的产物，分别在492 nm和450 nm波长有最高吸收峰，可用于比色测定。

AKP一般采用对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物，产物为黄色的对硝基酚，最佳吸收波长405 nm。

来源：丁香实验