总体设计
LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统采用紧凑、多功能的台式仪器，包括可互换的银色热模块循环仪单元。用户可以在 96 和 384 多孔板格式之间灵活切换，或者在透明或白色 LightCycler 480 多孔板之间进行选择。该系统由基于Windows XP的单独桌面数据站操作。®®
图 1： 带工作站的 LightCycler® 480 仪器
图 2：LightCycler 480 仪器及其构建块的内部视图。®
受益于新的银热块循环仪，实现无与伦比的温度均匀性
PCR特异性和产量与热循环系统快速准确地达到并保持反应温度的能力直接相关。十年前，罗氏通过基于毛细管的 LightCycler 1.5 和 2.0 系统在实时荧光定量 PCR 速度和准确性方面树立了标准。为了在 96 孔或 384 孔格式中实现相同的性能，LichtCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统中集成了一种新型的热块循环仪。加热和冷却是使用帕尔贴元件实现的。此外，新型热模块循环仪采用Therma-Base技术，可实现多孔板上所有样品的最佳传热和分布（见图3）。Therma-Base单元位于帕尔贴元件下方，可确保整个板的最佳热量分布，从而优化孔间均匀性以及最大化孔间测定的可重复性。Therma-Base单元下方的冷却元件具有最大化的内表面积，便于快速吸收热量。®®
图 3：LightCycler 480 384 孔热模块循环仪（左）和显示 Therma-Base 集成度的横截面（右）。®Therma-Base基于工作流体在薄真空室中的蒸发和冷凝，可实现快速的热量分布和温度平衡。
LightCycler 480 系统中内置的高性能银热模块循环仪可在 40 分钟内完成 PCR 运行（384 孔模块），同时在宽温度范围内为许多目标和应用实现最大的加热和冷却均匀性。®
用户可在几分钟内轻松互换 96 孔和 384 孔热模块 PC 仪（参见图 4），以适应不同的通量需求。块交换后不需要重新校准。
图 4：更换 LightCycler 480 块式循环仪单元和盖板。®系统的自动循环仪和覆盖物识别消除了耗时的重新校准运行。
LightCycler 480 热块循环仪温度均匀性的演示®
温度均匀性是qPCR在多孔板上再现性的主要先决条件。熔化温度（Tm） 分析提供了一个功能强大且高度灵敏的监视工具（参见图 5）。在相应的实验设置中，将相同的反应混合物（与互补的SimpleProbe探针结合的寡核苷酸）添加到板上许多不同位置的孔中，并在以恒定速率缓慢升高温度的同时监测荧光。在反应混合物的特定熔化温度下，荧光的降低达到最大值。高可重复性 Tm只有在熔化过程中，板上所有位置的温度同时达到相同值时，才能观察到值（见图5a）。另一方面，不均匀加热（例如，在没有Therma-Base的传统块式循环仪上）导致熔化温度看起来高于或低于预期值（见图5b）。
图 5：Therma-Base 层对 384 孔板的温度均匀性的影响。左：LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统，包括 Therma-Base;右图：另一个没有Therma-Base的实时荧光定量PCR系统。®
先进的高性能光学系统
LightCycler 480 仪器光学系统的出色性能源于高强度氙气灯，该灯可发出宽光谱的光。用于特定激发和发射的内置滤光片的灵活组合允许使用各种荧光染料和检测格式（见表1），适用于任何当前的实时荧光PCR应用（例如，使用HybProbe探针进行基于熔解曲线的基因分型）。®
图 6：LightCycler 480 检测单元的横截面示意图。®LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统中光学元件的特殊布置和最佳焦距确保了整个多孔板的特定信号激发和均匀的数据收集，而不受样品位置的影响。®
| 检测/检测格式 | 染料 | 激发（海里） | 检测（纳米） |
| SYBR Green l， HRM | SYBR Green I ResoLight HRM 染色 |
465 | 510 |
| 水解探针/ UPL探针单色/实时就绪检测 | 法姆 | 465 | 510 |
| 水解探头/UPL双色探头 * |
FAM VIC / 六角 / 黄色 555 |
465 533 |
510 580 |
| 水解探头 3 种颜色 |
FAM VIC / Hex Cy 5 / Cy 5.5 |
465 533 618 |
510 580 660 |
| 水解探头 4 种颜色 |
LightCycler Cyan 500 FAM LightCyCler Red 610 Cy 5 / Cy 5.5®® |
440 498 533 618 |
488 580 610 660 |
| HybProbe Probes Monocolor |
荧光素（供体） 轻骑车红640® |
498 | 640 |
| HybProbe探针 多色 |
荧光素 （供体） 轻骑车红 610 光骑车红 640 Cy 5 / Cy 5.5®® |
465 498 498 498 |
510 610 640 660 |
* 用于双色 FAM/VIC 和 UPL 检测的通用颜色补偿对象。
表 1：激发和发射滤光片、染料和检测格式概述。LightCycler 480 实时荧光定量 PCR 系统采用高强度氙气灯，可在宽波长范围 （430–630 nm） 上发光。系统的五个激励和六个发射滤波器可以任意组合使用。®
在用于激发和发射的多种过滤器组合之间进行选择，可以优化激发并减少反应混合物中不同染料之间的串扰。滤光片放置在两个滤光轮中，提供五种不同的激发波长（440、465、498、533 和 618 nm）和六种用于检测的波长（488、510、580、610、640 和 660 nm）。它们可以根据实验中使用的探针格式和染料的要求自由组合。
LightCycler 480 光学系统的主要优点：®
- 在选择荧光染料和检测格式方面具有最高的灵活性，适用于所有当前的PCR应用，包括高分辨率熔解（HRM）。
- 在整个板上准确捕获数据。
- 新型长通滤光片（705 nm 检测）。
- 通过预定义的模板增强 4 色水解探针和 3 色 HybProbe 探针检测的多重检测功能。
- 双色水解探针测定的最佳性能，由FAM / VIC或通用探针库双色测定的通用颜色补偿对象支持。
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