免疫共沉淀（Co-IP）
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
一、免疫共沉淀的优点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。
2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。
3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
二、免疫共沉淀的缺点
1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
3. 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
一、试剂准备
1. 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机。
2. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。
3. 加入预冷的RIPA Buffer(1 ml/107个细胞、10 cm培养皿或150 cm2培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm培养皿、75 cm2培养瓶）。
4. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。
5. 4℃，14000 g离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。
6. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。
7. 每1 ml总蛋白中加入100 ul Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。
8. 4℃，14000 g离心1 5min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。
9． （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。
10. 用PBS将总蛋白稀释到约1 ug/ul，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 ug/ul）。
11. 加入一定体积的兔抗到500 ul总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。
12. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。
13. 加入100 ul Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 ul “过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）。
14. 14000 rpm瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800 ul/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS。
15. 用60 ul 2x上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 ul足够上三道）。
16. 将上样样品煮5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5 min变性。
客户提供：
1、组织、细胞、蛋白质溶液等样品、用于免疫共沉淀的一抗及目的蛋白的相关信息；
2、如需构建基因的过表达载体，则还需提供过表达载体及其相关信息；
3、其他与免疫共沉淀相关信息。
实验结果：
1、免疫共沉淀电子图片及分析结果
2、相互作用蛋白鉴定结果，质谱鉴定结果和（或）western blot鉴定结果；
3、完整的实验步骤、使用仪器、软件检索参数等。
