定量PCR技术

简介

定量PCR是指以一种标准作对照，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量进行定量的技术。

根据原理的不同，目前主要采用的定量PCR方法包括极限稀释法、设立内参照物的定量PCR、荧光定量 PCR （fluorescence quantity PCR，FQ-PCR）等。

其中荧光定量PCR是最新发展起来的一项定量PCR技术。

原理

荧光定量PCR基本原理是在PCR反应体系中加人荧光基团，在PCR反应过程中连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化，当信号增强到某一阈值，此时的循环次数即循环阈值Ct（cycle threshold，Ct）被记录下来。

该循环参数Ct和PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系，利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和作图，制成标准曲线。

最后根据待测样品的Ct值，通过标准曲线就可以准确地确定起始模板的数量。根据所用的探针的不同，可以分为两种，一种是Taq-man荧光探针，另外一种是荧光染料。

Taqman的工作原理是在PCR的系统中加入一个荧光标记探针，该探针可与引物扩增的产物DNA模板发生特异性杂交，探针的5＇端标以荧光发射基团FAM（荧光发射峰值在518 nm处），3＇端标以荧光猝灭基团TAMRA（6-羧基四甲基罗丹明，荧光发射峰值在582 nm处）。

且末端碱基被磷酸化以防止探针在PCR扩增的过程被延伸，当探针保持完整时，猝灭基团抑制发射基团的荧光发射，发射基团一旦与猝灭基团发生分离，抑制作用被解除，518 nm处光密度增加被荧光系统检测到。

在PCR的复性过程中，探针与模板DNA杂交，在延伸过程中，Taq酶随引物延伸到探针与模板结合的位置时，发挥5＇→3＇的外切酶活性，将探针切断，FAM的荧光信号释放出来。

这样一来，模板每复制1次，就有1个探针被切断，伴随着1个荧光信号的释放。

荧光信号强度与PCR产物的数量是一对一的关系，因此该技术可以动态观察PCR的反应过程，对模板进行准确定量。

SYBR是不对称菁类荧光素，它非特异嵌合于DNA双螺旋结构中的小沟内，发出荧光信号，而不掺入链中的Sybr染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

此方法避免了设计、标记荧光探针和使用价格昂贵、复杂的试剂，适用于任何PCR扩增体系。

来源：丁香实验