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PCR-变性梯度凝胶电泳

简介

PCR-变性梯度凝胶电泳,是把 30~50 个 GC 碱基组成的核苷酸链加在其中一条引物的 5′ 端,通过 PCR 扩增目的基因,使扩增产物的一端含有 GC 碱基即 GC-clamp。由于 GC-clamp 为扩增片段中 Tm 值最高的区域,而其它部分因所含碱基的种类不同,其 Tm 值也不同,而且明显低于最高 Tm 值。将带有 GC-clamp 的 DNA 片段放入变性剂(尿素和甲酰胺)呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,当它泳动到一定浓度的变性区域时(此变性剂浓度的变性效果相当于 DNA 片段中最低解链温度区域的 Tm 值),双链 DNA 便发生部分解链。部分解链的 DNA 分子呈分枝状使迁移速度明显减慢,最后几乎处于停顿状态。只要 DNA 片段中有一个碱基发生变异,就会导致碱基间的协同效应,从 而引起 Tm 值的改变,在不同浓度的变性剂水平上发生部分解链而使泳动几乎停止,最终达到检测基因中发生的突变。目前,用于 PCR-变性梯度凝胶电泳的方法主要有 1 种:PCR-变性梯度凝胶电泳。

原理

PCR-变性梯度凝胶电泳的基本原理是把 30~50 个 GC 碱基组成的核苷酸链加在其中一条引物的 5′ 端,通过 PCR 扩增目的基因,使扩增产物的一端含有 GC 碱基即 GC-clamp。由于 GC-clamp 为扩增片段中 Tm 值最高的区域,而其它 部分因所含碱基的种类不同,其 Tm 值也不同,而且明显低于最高 Tm 值。将带有 GC-clamp 的 DNA 片段放入变性剂(尿素和甲酰胺)呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,当它泳动到一定浓度的变性区域时(此变性剂浓度的变性效果相当于 DNA 片段中最低解链温度区域的 Tm 值),双链 DNA 便发生部分解链。部分解链的 DNA 分子呈分枝状使迁移速度明显减慢,最后几乎处于停顿状态。只要 DNA 片段中有一个碱基发生变异,就会导致碱基间的协同效应,从而引起 Tm 值的改变,在不同浓度的变性剂水平上发生部分解链而使泳动几乎停止,最终达到检测基因中发生的突变。

应用

PCR-变性梯度凝胶电泳的常用应用领域如下:

检测人类的基因突变,检测从泥土、新鲜水或盐水中得到的细菌样品的生物多样性,检测肠道细菌群的生物多样性,法医鉴定中的线粒体 DNA 检测,HLA 基因组织分型,基因组差异分析,植物学中家谱分析等方面,更多领域的应用正不断被开发。

来源:丁香实验

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