免疫印迹在实验的过程中常出现的问题

免疫印迹在实验过程中常出现的问题：

        1. Western blot结果中的背景为什么较高? 

        可能的原因及建议 
        1.膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。 
        2.一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。 
        3.一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。 
        4.膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。 

        5.检测时曝光时间过长——减少曝光时间。

        2. Western blot结果中杂带较多

        可能的原因及建议 

        1.目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。 
        2.目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。 
        3.样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。 
        4.上样量过高，太敏感——适当减少上样量。 
        5.一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。 
        6.一抗不纯——纯化抗体 

        7.一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。

        3. Western blot结果中无信号或显示信号弱 
        可能的原因及建议 
        1.检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。 
        2.检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。 
        3.转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。 
        4.抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。 
        5.一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。 
        6.二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。 
        7.洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

        4. 其它现象： 
        1.膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。 
        2.反白（条带显白色）——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。 

        3.蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

        5. TBS与PBS的区别 
       PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在PH7.0以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。 

       Western blot中使用TBS和PBS均可，只是要根据需要选择合适的浓度。

        6. Western是否可以同时加两种或者多种一抗 

       通常情况下只加一种种一抗。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。

       7. PVDF与NC膜的区别 
       PVDF膜价格较贵，可重复使用，结合能力较强，但价格较昂贵。 

       NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性较PVDF膜差，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。

       8. Western一抗的选用 

       理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。

        9. Western抗体和ELISA抗体的区别 
        一般来说用于western的抗体主要识别氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 

 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。

       10. “短路”现象的产生和处理 

       如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

       11. Western Blot的染色
       1.阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。 
       2.胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。 
       3.生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。 
 
      12. 大分子量蛋白转移效率低的解决方法 

      可以在转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇能增加蛋白质和NC膜的结合能力，同时可以延长高分子量蛋白质转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；选用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。

       13. DAB显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理 

       DAB显色在辣根过氧化酶的作用下能形成一种灰褐色的产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。

       14. 酶显色与荧光显色的优缺点 
        免疫酶技术就是用酶标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应并结合，结合形成的复合物中所含有的酶分子遇到底物时，会催化底物水解、氧化或还原，从而发生显色反应。免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。 
       免疫荧光技术中的荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，但免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法。酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。